МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
23.07.2015
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

1. Общие положения.

2. Схема проведения лабораторных исследований. 3. Отбор и подготовка проб к исследованию. 4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммуно-флуоресценции     в мазках-отпечатках. 5. Выделение эпизоотического вируса КЧС из патологического материала    инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15)    и идентификация его реакцией прямой иммунофлуоресценции. 6. Обнаружение специфических антител в сыворотках крови переболевших    классической чумой свинец реакцией нейтрализации флуоресцирующих    микробляшек и реакцией непрямой иммунофлуоресценциии. 7. Выделение н идентификация вируса КЧС биопробой на животных. 8. Постановка лабораторного диагноза. 9. Срок исследований.

Приложение 1. Материалы и реактивы для постановки реакции прямой и непрямой    иммунофлуоресценции. 2. Поддержание и выращивание перевиваемой культуры клеток    почки поросенка (РК-15). 3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС. 4. Приготовление тест-препаратов для постановки РНИФ.

    МИНИСТЕРСТВО                              СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                               РОСCИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                         УТВЕРЖДАЮ                                            Заместитель руководителя                                           Департамента ветеринарии № 13-4-2/809 от 30 декабря 1996 г.           В.В.Селиверстов

Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней

1.Общие положения

1.1.Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на: обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в клетках мазков-отпечатков проб органов;

выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала иноку- ляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) н его идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценции;

обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших класси- ческой чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек или реакцией непрямой иммунофлуоресценциии;

выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.

Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют "Набор

препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней".

1.2. При проведении лабораторной диагностики руководствуются "Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях", утвержденными Мини- стерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 года.

2. Схема проведения лабораторных исследований

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для исследования.

2.2. Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой иммунофлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции  культуры клеток (проводится одновременно).

2.3. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) с целью обнаруже- ния специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов.  По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предваритель- ный диагноз.

2.4. Инокуляция культуры клеток РК-15 экстрактами суспензий проб исследуе- мых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации  эпизоотического вируса КЧС.

2.5. Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуо- ресцирующих микробляшек (РИФМ) или реакции непрямой иммунофлуо- ресценции (РНИФ). Серологические исследования проводят в тех случаях, когда пробы крови получены от свиней, подозреваемых в переболевании классической  чумой (ретроспективные исследованиям из хозяйства не применяющих вакцинацию  против КЧС в течение последних 2-х лет.

2.6. Постановку биопробы проводят только по указанию Департамента ветерина- рии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологического обследо- вания, получены отрицательные результаты лабораторных исследований.

3. Отбор и подготовка проб к исследованию.

3.1.Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериаль- ные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из  грудной или трубчатой кости) от 3-5 животных, убитых в стадии агонии или не  позже чем через 2-3 ч. после гибели.

3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5-10 г каждой, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Флаконы с наружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным  20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же раствором, угадывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В  случае длительной транспортировки (более 2 сут.) пробы органов заморажива- ют. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют на- рочным в лабораторию с сопроводительным документом.

3.3. При ретроспективной диагностике направляют 5-10 проб крови (по 5-8 куб. см) от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой. Кровь  берут не ранее 15-20 сут. после установления признаков болезни.

3.4. В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по 2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт- эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхно- сти среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом орга- на). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (ЗО-60  мин.) и помещают в химический стакан с холодным (2-4гр.С) ацетоном. Фикса- цию проводят в камере бытового холодильника при 4 (±2) гр.С в течение 10-15  мин. Затем мазки-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют  для постановки РПИФ. Хранят мазки-отпечатки при 4 (+-)гр.С не более 3 сут.

Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

3.5. Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке со стерильным порошком из стеклам или песком и готовят 20%-ную суспензию на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии дважды замораживают при минус 10-12 гр.С оттаивают при 3О-37 гр.С и центри- фугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500 - 3000 об/мин в течение 10- 15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/куб.см пенициллина и 100 мг/куб.см стрептомицина (конечная концентрация), выдержи- вают 1 ч. при 37(±0,5)гр.С и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном  0,85 %-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток ис- пользуют как исходные (неразведённые) экстракты, так и разведенные.

3.6.Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч. в термостате при 37(±0,5)гр.С или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгу- сток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на 10-14 ч. Сыворотку отсасывают и используют для исследования.

          4.Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммуно-                   флуоресценции в мазках-отпечатках.

4.1.Содержимое ампулы ФИТЦ - иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 куб.см  дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фос- фатно-солевом буферном растворе - ФСБ (приготовление буферного раствора в  Приложении, п.1.), указанное на ампуле.

4.2. Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п.3.4., помещают на ка- пли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края  предметных стекол, находящихся во влажной камере, и выдерживают при  57(±0,5)гр.С в течение 30 мин.

4.3. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными  концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помешают в  цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку.  Отмывание мазков-отпечатков от несвязавшихся или неспецифически связавшихся  ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буфер- ный раствор через 10 мин.

4.4. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсу- шивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разве- денного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжи- ренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.

4.5. Люминесцентную микроскопию препаратов проводят в сине-фиолетовом свете  при освещении их сверху, через объектив на микроскопах типа "ЛЮМАМ". Возбу- ждающий светофильтр ФС-1-2 или СС-15-2; запирающий ЖС 18+ ЖЗС-19. Препараты  последовательно просматривают при увеличении 7х10, 7х40 ("сухая" микроско- пия ), затем, при необходимости, в иммерсионной системе при увеличении  7х90, используя неразведенный нефлуоресцирующий глицерин.

4.6. Специфическую флуоресценцию учитывают в лнмфоидных клетках паренхимы  селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в  эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, рас- положенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого,  диффузного свечения цитоплазмы антигенсодержащих клеток.

4.7. Учет и оценка результатов.

Проводят по условной четырёхкрестовой шкале при увеличении 5х40: (++++,+++,++,+) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с  яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный,  ( ± ) обнаружение в 5-10-ти полях зрения единичных групп, состоящих из 3-5  клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнитель- ный, - отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценци- ей. Свечение клеток тускло-зеленое - результат отрицательный. Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учи- тывают.

  5. Выделение эпизоотического вируса КЧС из патологического материала     инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15)         и идентификация его реакцией прямой иммунофлуоресценции.

5.1. Подготовленные для исследования экстракты 20 %-ных суспензий проб ор- ганов (п.3.5.) вносят по 0,5-0,6 куб.см в пробирки с культурой клеток РК- 15, выращенной на стеклянных пластинках из покровных стекол, (выращивание  культуры клеток РК-15 в Приложении п.2), предварительно удалив ростовую  среду. Для инокуляции суспензии каждого органа берут не менее 8 пробирок.

Пробирки помещают в термостат 37 (±0,5)гр.С на 2 ч. По истечении указанного времени инокулюм удаляют, монослой клеток однократно промывают средой Иг- ла(МЕМ) без сыворотки. Затем в пробирки вносят по 2,0 куб.см питательной  среды, содержащей 2 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота, (поддер- живающая среда) и инкубируют 24-96 ч. Через 24 ч после инокуляции поддержи- вающую среду меняют на свежую. В качестве контроля культуры клеток (отрица- тельные препараты) 8 пробирок оставляют интактными, предварительно сменив  ростовую среду на поддерживающую.

5.2. Каждые 24 ч по 2 пластинки с культурой клеток, инокулированной ис- ледуемым экстрактом суспензии каждого органа, извлекают из пробирок, встав- ляют в расщепы спичек с номерами, обсушивают на воздухе до полного удаления  влаги и фиксируют холодным ацетоном в течение 10 мин. (п.3.4.).

5.3. С препаратами, приготовленными по п.5.2., ставят РПИФ и проводят люми- несцентную микроскопию (п.п. 4.2.- 4.5.).

5.4. Оценка результатов.

5.4.1. При обнаружении специфической желто-зеленой или зеленой диффузной  флуоресценции в цитоплазме клеток, расположенных группами ("флуоресцирующие  микробляшки") и отсутствии ее в отрицательных препаратах, вирус КЧС считают  выделенным и идентифицированным, а результат положительным.

5.4.2. В случае обнаружений тусклой, диффузной зеленой флуоресценции в  клетках препаратов и отсутствии "флуоресцирующих микробляшек" после 96- часовой инкубации, проводят 2 дополнительных пассажа.

Для этого, пробирки с инокулированной культурой 1-го пассажа, взятые через  96 ч культивирования (п.5.1.) дважды замораживают при минус 10-12 гр.С, от- таивают при 30-37гр.С и культуральную жидкость используют в качестве иноку- люма для проведения 2-го пассажа (п.п.5.1.- 5.4.). 3-й пассаж проводя ана- логично.

В случае отсутствия "флуорецирующих микробляшек" в третьем пассаже резуль- тат считают отрицательным.

     6.Обнаружение специфических антител в сыворотках крови переболевших        классической чумой свинец реакцией нейтрализации флуоресцирующих             микробляшек и реакцией непрямой иммунофлуоресценциии.

6.1. Постановка реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РИФМ).

6.1.1. Исследуемые сыворотки и контрольные (специфическую и нормальную сы- воротки, взятые "Набора препаратов", перед постановкой реакции растворяют  0,5 куб.см дистиллированной воды), прогревают при 56 гр.С 50 мин. и разве- дет в пенициллиновых флаконах средой Игла (МЕМ) 1:8 (к 0,2 куб.см сыворотки  добавляют 1,4 куб.см среды).

6.1.2. Во флаконы с разведенными сыворотками вносят равный объем 1000 ККИД  50/куб.см вируса КЧС, шт. "Ши-Мынь", (титрование вируса и расчет рабочей  дозы вируса в Приложении п. 3), тщательно встряхивают и инкубируют в тече- ние 60 мин в термостате при 37(+-5)гр.С.

6.1.3. После инкубации по 0,5 куб.см смеси вносят в пробирки с выращенной  культурой клеток РК-15 на стеклянных пластинках, предварительно удалив рос- товую среду.На каждую сыворотку берут по 4 пробирки. В качестве контроля  токсичности разведенные сыворотки без вируса в объеме 0,5 куб.см вносят в 4 пробирки и 4 пробирки оставляют интактными, сменив ростовую среду на под- держивающую ("контроль культуры клеток").

6.1.4. Через 2 ч смесь из пробирок удаляют, монослой дважды промывают сре- дой Игла (МЕМ) и заливают поддерживающую среду. Каждые 24 ч культуру клеток  просматривают под малым увеличением светового микроскопа для контроля деге- нерации клеток.

6.1.5. При отсутствии дегенеративных изменений клеток через 48 ч после вне- сения смесей пластинки извлекают из пробирок, готовят препараты ( п.5.2.), ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции (п.4.2-4.4) и проводят люминес- центную микроскопию (п.4.5.).

6.1.6. Оценка результатов

Результаты начинают оценивать в том случае, если в препаратах, об- работанных смесью "нормальная сыворотка-вирус", обнаруживают флуоресци- рующие микробляшки при их отсутствии в препаратах, обработанных смесью"  специфическая сыворотка-вирус".

При отсутствии флуоресцирующих микробляшек в препаратах, обработанных сме- сью "исследуемая сыворотка-вирус", результат считают положительным, в слу- чае обнаружения - отрицательным.

6.2. Постановка реакции непрямой иммунофлуоресценцин (РНИФ).

6.2.1. Положительные и отрицательные тест-препараты (приготовление в Приложении п. 4) помещают на капли исследуемых и контрольных (специ- фической и нормальной) сывороток, разведенных 1: 20, нанесенные на края  предметных стекол во влажной камере. На каждую сыворотку берут по 2 положи- тельных и отрицательных тест-препаратов. Обработку тест-препаратов сыворот- ками проводят при 37(±0,5)гр.С в течение 30 мин.

6.2.2. Отмывание тест-препаратов от несвязавшихся антител проводят по  п.4.3.

6.2.3. Тест-препараты слегка подсушивают н помещают на капли раствора ФИТЦ- иммуноглобулинов антисвиных в рабочем разведении, нанесенные на края пред- метных стекол во влажной камере. Обработку тест-препаратов ФИТЦ- иммуноглобулинами антисвиными проводят при 37(±0,5)гр.С в течение 30 мин.

6.2.4. Отмывание тест-препаратов от несвязавшихся ФИТ-нммуноглобулинов ан- тисвиных, подготовку препаратов для люминесцентной микроскопии и микроско- пию проводят по п.п.4.3 - 4.5.

6.2.5.Оценка результатов

Проводят по интенсивности свечения антигенсодержащих клеток флуоресцирующих  микробляшек положительных и отрицательных тест-препаратов, обработанных ис- следуемыми и контрольными сыворотками: - яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов  в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных ис- следуемыми и контрольными сыворотками: - яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов  в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных иссле- дуемыми сыворотками - результат положительный;

-тусклое зеленое свечение в клетках положительных тест-препаратов - резуль- тат отрицательный.

В положительных тест-препаратах, обработанных специфической сывороткой на- блюдают яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифнческих ан- тигенов в зараженных клетках и отсутствие подобного свечения в специфиче- ских тест-препаратах, обработанных нормальной сывороткой: в отрицательных  тест-препаратах, обработанных специфической и нормальной сыворотками наблю- дают тусклое зеленое свечение цитоплазмы клеток.

7. Выделение н идентификация вируса КЧС биопробой на животных.

7.1. Для постановки биопробы используют 4-х здоровых поросят 2-4 месячного  возраста, полученных от свиноматок, не вакцинированных против КЧС и не со- держащих в сыворотке крови специфических антител к вирусу КЧС, и 2-х поро- сят такого же возраста, иммунных против КЧС. Для иммунизации поросятам вво- дят по 1000 ИмД 5о/куб.см вирусвакцины ЛК ВНИИВВиМ против классической чумы  свиней и через 10-15 сут. после прививки используют для постановки биопро- бы.

7.2. Животных помещают в разные боксы по два подсвинка в каждый станок.

7.3. Двух неиммунных подсвинков содержат в отдельном помещении в качесте  контрольных.

7.4. Содержание и кормление животных должны соответствовать зоотехническим  нормам.

7.5. Непосредственно перед введением готовят экстракты 20%-ных суспензий  лимфатических узлов и селезенки подозреваемых в заболевании классической  чумой свиней (п.3.5.) и фильтруют через фильтр "Миллипор" (или его аналог)  с величиной пор 0,22-0,48 мкм.

Равные объемы экстрактов органов смешивают, при этом общий объем смеси дол- жен быть не менее 20 куб.см.

7.6. Подготовленный материал вводят 2-м восприимчивым и 2-м иммунным живот- ным внутримышечно, соблюдая правила асептики, с внутренней стороны бедра в количестве 3-5 куб.см каждому поросенку. За животными ведут клиническое на- блюдение с ежедневным измерением температуры тела в течение 15 сут.

7.7. 0ценка результатов.

7.7.1. При повышении температуры тела у невакцинированных поросят до 40,5- 42гр.гр.С, угнетении, отсутствии аппетита через 3-5 сут. после введения ис- следуемого материала, на 5-10 сут. после повышения температуры тела выше  нормы проводят убой поросят и отбор проб органов (п.3.1.), их подготовку  (п.3.5.)и исследование (п.п.5.1.-5.4.)с целью реизоляции и идентификации  вируса КЧС. При выделении и идентификации вируса, результат биопробы счита- ют положительным.

7.7.2. При установлении заболевания и гибели невакцинированных и вакцинированных против КЧС поросят, проводят дифференциальные лабораторные исследования на африканскую чуму свиней.

8.Постановка лабораторного диагноза.

Диагноз на классическую чуму свиней считают установленным в случае: - выделения и идентификации вируса КЧС в одной из исследуемых проб органов,

- выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных из  хозяйства не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2-х лет,

- получения положительных результатов биопробы на животных, реизоляции и идентификации вируса.

9. Срок исследований: вирусологических - 2-12 сут, серологических - 1-2 сут, биопроба - 12-24 сут.

Приложение к Методическим указаниям по лабораторной диагностике классической чумы свиней 

    1. Материалы и реактивы для постановки реакции прямой и непрямой                         иммунофлуоресценции.

1.1. Предметные стекла по ГОСТ 9284-75, обезжиренные спирт-эфиром, взятыми в соотношении 1:1.

1.2. Влажная камера (чашка Петри) или стерилизатор с увлажненной фильтро- вальной бумагой.

1.3. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСК) 0.01 М рН 7.2 - 7.5 готовят,  смешивая:

а) 0,01 М раствор двузамещённого фосфата натрия (1,42 г Nа2 НРО4 безводного  или 1,78 г N2HPO4 x 2H2O) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной  до 1 куб.дм,

б) 0,00 М раствор однозамещённого фосфата калия (1,36 г КН2РО4) с 0,85%  хлористого натриям воды дистиллированной до 1 куб.дм.

Для приготовления 0,0 1М ФСБ с рН 7,2-7,4 смешивают 850 куб.см раствора "а"  с 250 куб.см раствора "б".

1.4. Штатив для отмывки препаратов. Изготавливают из пенопласта размером  1Ох10х2 см или из деревянной дощечки такого же размера.

1.5. Банка цилиндрическая по ГОСТ 23932-79 .

1.6. Нефлуоресцирующий глицерин или глицерин для люминесцентной микроскопии  (фирмы "Меrck" аrt.4095 или любой другой фирмы.

1.7. Парафин по ГОСТ 23683-79.

1.8. Магнитная мешалка любого типа.

1.9. "Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической  чумы свиней".

         2.Поддержание и выращивание перевиваемой культуры клеток                          почки поросенка (РК-15)

2.1. Работу проводят в изолированном, стерильном помещении. При одновремен- ной работе с другими линиями клеток принимают меры для предотвращения кон- таминации одной линии клетками другой.

2.2. Материалы, необходимые для поддержания и культивирования культуры клеток РК-15.

Среда Игла(МЕМ), содержащая L-глутамин (300 мг на 1 куб.дм).

Сыворотка фекальная крупного рогатого скота (крс), не содержащая антител к  вирусу диареи крупного рогатого скота.

0,25% раствор трипсина. 0,02% раствор версена. Пенициллин, стрептомицин. Пробирки биологические. Флаконы (матрасы) РУ. Покровные стекла 18х18. Стерильные центрифужные флаконы 100-500 куб.см. Рефрижераторная низкоскоростная центрифуга.

2.3. Культивирование клеток.

2.3.1. Суспензию клеток готовят на среде Игла(МЕМ), содержащей 5-10% фе- тальной сыворотки крупного рогатого скота, прогретой при 56(±2)гр.С в тече- ние 30 мин - ростовая среда. Ростовую среду считают пригодной для работы,  если монослой формируется на 3-4 сут. при посадачной концентрации клеток  100 000 в 1 куб.см и объеме суспензии 100 куб.см /флакон РУ. Монослой кле- ток долькой представлять собой единый пласт клеток с четким разделением  границ между ними. При наличии округлых клеток с вакуолями, включениями и  другими признаками цитопатологии данную партию культуры выбраковывают.

2.3.2. Пассаж (пересев) клеток проводят после образования сплошного моно- слоя клеток. Для этого из матраса удаляют ростовую среду и вносят подогре- тую до 37(+-0,5)гр.С смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного рас- твора версена в соотношении 1:9. Матрас помещают в термостат на 5-7 мин.  Как только часть клеток начинает отслаиваться от стекла, 90-95% дисперги- рующего раствора удаляют, добавляют небольшое количество ростовой среды и  матрацы энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и берут пробу суспензии для подсчета клеток. Суспензию клеток разводят ростовой средой до концентрации 100 000 клеток/куб.см.К приготовленной суспензии  клеток добавляют антибиотики из расчета 100 ЕД/куб.см пенициллина и 100  мг/куб.см стрептомицина и разливают во флаконы РУ по 100 куб.см и по 2  куб.см в пробирки с покровными стеклами. Инкубируют при 37(±0,5)гр.С. В  случае неудовлетворительного роста клеток и формирования монослоя ростовую  среду меняют на свежую.

      3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС.                                                          -1     -6 Вируссодержащую культуральную жидкость, разведенную от 10  до 10  раствором Эрла или Хенкса, вносят в объеме 0,5 куб.см в пробирки с культу- рой клеток РК-15, выращенной на покповных стеклах, при этом ростовую среду предварительно удаляют. На каждое разведение вируссодержащего материала бе- рут по 4 пробирки с хорошим монослоем.

После 2 ч контакта при 37(±0,5)гр.С вируссодержащий материал удаляют и вносят по 2 куб.см поддерживающей среды и инкубируют 3 сут. при 37(±0,5)гр.  С. Затем пластинки из пробирок извлекают, высушивают, обрабатывают холодным  ацетоном. После фиксации ацетон с препаратов удаляют обсушиванием на возду- хе (1-2 мин) и ставят РПИФ.

Титром вируса КЧС считают наибольшее его разведение, при котором обнаружи- вают флуоресцирующие микробляшки или единичные клетки, содержано специфиче- ский цитоплазматический антиген вируса. Вычесляют титр по методу Рида и  Менча (или его модификации), выражая его в клеточно-культуральньх 50%-ных  инфекционных дозах (КИИД 5о/объём).

4. Приготовление тест-препаратов для постановки РНИФ.

4.1. Перевиваемую культуру клеток почки поросенка (РК-15), выращенную на  покровных пластинках в пробирках , заражают стандартным вирусом КЧС (штамм  "Ши-Мынь") в дозе 0,001-0,0001 ККИД 5о/клетка в объеме 0,5 куб.см на про- бирку, предварительно удалив ростовую среду, и помещают в термостат при  37(±0,5)гр.С на 2 ч. Затем, удалив вируссодержащую) жидкость вносят поддер- живающую среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в условиях термостата  при 37(±0,5)гр. С.

4.2. Через 48 часов инкубации, пластинки с зараженной культурой клеток из- влекают, укрепляют в расщепы спичек, высушивают, обрабатывают холодным аце- тоном в течение 10 мин и хранят в герметически закрытом контейнере при тем- пературе минус 10-12гр.С. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично,  исключая этап заражения культуры клеток.