Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания. МУК 4.2.2413-08
23.07.2015
Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания. МУК 4.2.2413-08

Утверждаю

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г.ОНИЩЕНКО 29 июля 2008 года

Дата введения - 1 сентября 2008 года

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора; ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора; ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора; ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора; ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора; ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора; ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора; ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. N 2). 3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 29 июля 2008 г. 4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г. 5. С введением в действие данных Методических указаний при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", утвержденные 01.09.86 начальником Главного управления ветеринарии Госагропромкомитета СССР и начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР, применению не подлежат.

1. Область применения

1.1. Настоящие Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций. 1.2. В Методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

Список сокращений

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии; ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля; ГКИ - Государственный контрольный институт; ДДМ - диско-диффузионный метод; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ИФА - иммуноферментный анализ; кДа - килодальтон; ЛФ - летальный фактор; МПА - мясопептонный агар; МПБ - мясопептонный бульон; МПК - минимальная подавляющая концентрация; МФА - метод флуоресцирующих антител; ОФ - отечный фактор; ПА - протективный антиген; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РНГА - реакция непрямой гемагглютинации; РТНГА - реакция торможения непрямой гемагглютинации; "СОПЭК" - среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы; ЭДТА - этилендиаминтетераацетата динатриевая соль; DCL - абсолютная летальная доза; LD - половинная летальная доза; 50 MLVA - метод анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03". 2.2. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. СП 1.2.036-95". 2.3. "Сибирская язва. СП 3.1.089-96, ВП 13.3.1320-96". 2.4. Практическое руководство "Специфическая индикация патогенных биологических агентов", 2006. 2.5. Методические указания "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03". 2.6. Методические указания "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04". 2.7. Методические указания "Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I - IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034-01". 2.8. Методические рекомендации по использованию этилового спирта с 3% перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы, 1984. 2.9. Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов, 1984. 2.10. Методические рекомендации "Использование 0,05 - 0,1%-ного раствора Твина-80 как разводящей жидкости для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба", 1986. 2.11. Методические рекомендации "Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба", 1989. 2.12. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения, Госкомсанэпиднадзор РФ, 1995. 2.13. Методические рекомендации "Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики". МЗ РФ, ЦНИИЭ, 2004. 2.14. Методические рекомендации "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. МР 0100/3556-04-34", 2005. 2.15. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам, 1990.

3. Общие положения

Сибирская язва. (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями. В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов; непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля. В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма). Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение. Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

3.1. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы. - B. anthracis, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Bacillaceae, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные B. cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб B. weichenstephanensis. Морфология B. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бескапсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор. В мазках из культур, выросших на питательных средах, палочки (размеры 1 - 1,5 х 6 - 8 - 10 мкм) расположены длинными цепочками, концы микробов в окрашенных препаратах обрублены и цепочка напоминает бамбуковую трость с коленчатыми сочленениями (Прилож. 7, рис. 1 - не приводится). В мазках из патологического материала палочки расположены поодиночке, попарно или короткими цепочками, окружены хорошо выраженной капсулой, зачастую общей для группы микробов (Прилож. 7, рис. 2 - не приводится). Спорообразование. При выращивании возбудителя на питательных средах и в условиях окружающей среды при свободном доступе кислорода воздуха, определенной влажности и температуре от 12,0 до 42,5 °С образуются споры овальной формы размером 0,8 - 1 х 1,2 - 1,5 мкм. В каждой вегетативной клетке (спорангии) образуется только одна спора, располагающаяся центрально, ее диаметр не превышает ширину тела микробной палочки (Прилож. 7, рис. 3 - не приводится). Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, pH среды, температуры выращивания, влажности и др. При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 °С) и других факторов. Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34 - 37 °С, оптимальное значение pH 7,2 - 7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации. При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36 +/- 1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7 х 10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (Прилож. 7, рис. 4 - не приводится). Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-ной пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (Прилож. 7, рис. 5 - не приводится). Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью, и при посеве уколом в столбик 10 - 12%-ного мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3 - 5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3 - 5% дефибринированной крови барана через 20 - 24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12 - 18 ч при 37 °С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не свертывается даже при 5 - 6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6 - 10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительно к пенициллину и при выращивании на МПА или МПБ в присутствии 0,5 - 0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образует цепочки из шарообразных клеток - "жемчужное ожерелье" (Прилож. 7, рис. 6 - не приводится). До 95% штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами "Гамма", "К" и Fah-ВНИИВВиМ (Прилож. 7, рис. 7 - не приводится). Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков - цефалоспоринам I поколения, тетрациклинам, рифампицинам, аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалоспоринам II - IV поколения устойчив. Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных. Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях. Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма. Типичные вирулентные штаммы B. anthracis образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1%-ном бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5 - 50% углекислоты, или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40% инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60% раствора Хенкса. На 1%-ном бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (Прилож. 7, рис. 8 - не приводится). Экзотоксин играет ведущую роль в патогенезе сибиреязвенной инфекции и формировании специфического иммунитета. Сибиреязвенный экзотоксин относится к бинарным двухкомпонентным белковым токсинам AB-типа и обладает двумя разными биологическими активностями. Компонентами токсина являются ОФ, ПА и ЛФ. Это белки с молекулярными массами 89, 83 и 85 кДа. В настоящее время можно встретить сообщения о двух токсинах - отечном (ОФ + ПА) и летальном (ЛФ + ПА), в которых эффекторную функцию выполняют ОФ и ЛФ (A-субъединицы), а акцепторную и интернализирующую функции - ПА (B-субъединица). Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токсинообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами pXO1 и pXO2. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты. В природе наряду с "классическими" диплазмидными штаммами с меньшей частотой встречаются атипичные моно- и бесплазмидные варианты возбудителя.

3.2. Исследование на сибирскую язву

Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку основных и дополнительных тестов идентификации, использование МФА для обнаружения антигенов и антител к ним, постановку ПЦР, биопробы и реакции преципитации. У человека и свиней в случае невозможности установить диагноз вышеперечисленными методами обязательна постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном.

4. Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования

Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)", СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности".

4.1. Материал для исследования

а) от больных или подозрительных на заболевание людей в зависимости от формы заболевания - содержимое везикул, отделяемое карбункула или язвы, струпья, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, моча, испражнения, экссудаты; б) трупный материал - кровь, экссудаты, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов и др.); в) материал от животных; г) продовольственное сырье и продукты животного происхождения; д) объекты окружающей среды - почва, трава, фураж, подстилка, вода и т.д. Забор всех видов материала осуществляется в стерильную стеклянную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб. Иммунофлуоресцентным, серологическим и бактериологическим методами исследуется соответствующий материал из общей пробы.

4.2. Взятие материала от животных

4.2.1. Для бактериологического исследования В случае падежа животного в лабораторию направляют ухо и мазок, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно ухо туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного или в ходе вынужденного убоя, все манипуляции по вскрытию прекращают и на исследование направляют кровь, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения), костный мозг (из грудины или канала бедренной кости). Материалы от трупа необходимо брать и исследовать как можно раньше, так как из-за развития посторонней микрофлоры трудно выделить чистую культуру возбудителя сибирской язвы. От трупов свиней в обязательном порядке отбирают заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани. У животных с подозрением на заболевание или больных берут на исследование кровь с помощью шприца из яремной вены или из вены уха, а у свиней - из вены хвоста. В отдельных случаях у животных берут на исследования пробы каловых масс. 4.2.2. Для исследования методом ПЦР Микробиоптат/микроаутоптат (пунктат) помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 - 1,7 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками, содержащие 0,1 - 0,2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида или транспортной среды N 1 (Прилож., 1.8). Макробиоптат/макроаутоптат (кусочки тканей массой 0,1 - 1,0 г) помещают в контейнер с 0,9%-ным раствором натрия хлорида или транспортной средой N 2 (Прилож., 1.9).

4.3. Взятие материала от человека

4.3.1. Для бактериологического исследования Забор материала от больных людей должен производиться до начала специфического лечения. Необходимо осторожно обработать спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула. Содержимое везикулы отсасывают стерильным шприцем или стерильной тонко оттянутой обломанной пастеровской пипеткой. В пипетку обычно набирается небольшое количество опалесцирующей желтоватой жидкости в объеме, достаточном для посева на агаровую среду и для приготовления мазка. Затем иглу или кончик пипетки помещают в пробирку с питательным бульоном. Отделяемое язвы снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Фрагменты отторгнутого струпа снимают влажным тампоном или пинцетом. При всех формах заболевания из крови, взятой на анализ, возбудитель сибирской язвы можно выделить уже при первом повышении температуры тела. Кровь берут из локтевой вены стерильным шприцем в объеме 3 - 5 мл (с учетом необходимости проведения бактериологических, серологических исследований и ПЦР). Сразу же, непосредственно у постели больного, по 0,1 - 0,2 мл крови засевают на питательные среды (агар и бульон Хоттингера, pH 7,2 - 7,5). Одновременно на предметных стеклах делают 2 - 3 тонких мазка, а остатки крови оставляют для получения сыворотки. Если невозможно сразу же исследовать кровь, ее из шприца переносят в стеклянную посуду (бактериологические пробирки). Мокроту и испражнения собирают в стерильную посуду. Для высева на питательные среды отбирают слизь с примесью крови. При висцеральных формах сибирской язвы и менингите исследуют спинномозговую жидкость, которую отбирают после пункции поясничной, субокципитальной области или мозговых желудочков в количестве 0,5 мл в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 - 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой. При подозрении на ингаляционное заражение исследуют также мазки из полости носа. Их берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2 - 3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 - 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой с 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Погрузив рабочую часть зонда в раствор натрия хлорида, вращают зонд в течение 10 - 15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку. 4.3.2. Для исследования методом ПЦР Забор крови проводят из локтевой вены в объеме 3 - 5 мл. Кровь аккуратно (без образования пены) переносят в стерильную пробирку, содержащую 6%-ный раствор ЭДТА в отношении 1:20 к объему крови. Используют одноразовые шприцы, иглы и посуду. Содержимое везикул, карбункулов в объеме 0,1 - 0,3 мл и фрагменты струпьев массой 10 - 100 мг помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 - 1,7 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками, содержащие 0,1 - 0,2 мл транспортной среды N 1 (Прилож., 1.8). Спинномозговую жидкость после пункции одноразовой пункционной иглой отбирают в количестве 0,5 мл в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 - 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой. Мазки из полости носа берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах, как и для бактериологического исследования, с той разницей, что тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 - 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой с транспортной средой N 2 (Прилож., 1.9). Транспортирование биологического материала для исследования методом ПЦР при отсутствии транспортной среды осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2 - 8 °С. Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

4.4. Взятие материала из сырья животного происхождения и объектов окружающей среды

Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи, для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта. 4.4.1. Для бактериологического исследования 4.4.1.1. Мясо и мясные продукты Из материала, доставленного на исследование, отбирают образцы весом 10 - 30 г, из мяса - участки с лимфоидной тканью или кровоизлияниями. 4.4.1.2. Шерсть Шерсть для исследования отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе. 4.4.1.3. Кожа и кожсырье Берут кусочки кожи размером 3 х 3 см с периферических незагнивших и незаплесневевших участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах. 4.4.1.4. Почва При отборе проб почвы следует руководствоваться "Методическими рекомендациями по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов" (М., 1984). Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом при заборе проб с большой территории обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб почвенным буром. Перед взятием почвы на территории скотомогильника верхний ее слой снимают на 2 - 3 см и пробы берут на глубине до 1,5 - 2,0 м через каждые 25 см не менее 200 г в пробе. Особое внимание обращают на костные и другие животные остатки, которые также отбираются для исследования. Пробы упаковываются в том же порядке. Каждую пробу весом около 100 - 200 г помещают в мешочек из плотной ткани с завязками или в лабораторную посуду (широкогорлый флакон, банку), закрытую такой же тканью. Нельзя помещать пробы почвы в полиэтиленовые мешочки или в плотно закрытую посуду, так как в этих условиях происходит бурное развитие актиномицетов, губительно действующих на возбудитель сибирской язвы. Вынутую из глубины и не использованную для проб почву с целью обеззараживания смешивают с сухой хлорной известью, содержащей 25% активного хлора, в соотношении 1 часть хлорной извести на 3 части почвы, слегка увлажняют и сбрасывают в шурф. Место отбора проб дезинфицируют раствором хлорной извести, содержащей 5% активного хлора, инструменты - огнем паяльной лампы. 4.4.1.5. Вода Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10 - 15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют так же, как пробы почвы. 4.4.1.6. Смывы с объектов внешней среды Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя с помощью стерильного тампона, смоченного стерильной дистиллированной водой. Площадь смыва одним тампоном около 100 кв. см. Затем тампоны помещают в пробирки, заливают стерильной дистиллированной водой (15 мл) и закрывают пробкой. 4.4.1.7. Корма Концентрированные корма (зерно, отруби, комбикорм) отбирают в зависимости от условий хранения. При наличии незатаренных кормов первичные пробы отбирают из расчета 1 проба не менее 400 г на 4 кв. м поверхности, но не менее 5 проб от каждого закрома, партии. Первичные пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев корма равномерно по всей площади. При наличии затаренных кормов отбор проводят от каждой упаковочной единицы. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы. Пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды при помощи ножниц и пинцета из расчета 1 проба (40 г) на 4 кв. м площади скирды. Зеленую массу отбирают как грубые корма. Корнеплоды в зависимости от величины отбирают из расчета 1 - 3 штуки на 4 кв. м площади бурта, отсека. С отобранных корнеплодов скальпелем в местах, где имеются остатки земли, срезают поверхностный слой, который используют для исследования. В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных первичных проб данной партии, емкости и т.п. Масса средней пробы должна быть не менее 500 г. 4.4.1.8. Воздух Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов, снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого воздуха должен составлять не менее 3 - 5 куб. м. 4.4.2. Для исследования методом ПЦР Для исследования методом ПЦР отбирают пробы из объектов окружающей среды, пищевых продуктов (мясо и продукты животного происхождения), сухих и сочных кормов, подстилки, шкур, шерсти, почвы, воды, смывов с поверхностей. Отбор проб осуществляют так же, как и для бактериологических исследований.

4.5. Направление материала на исследование

Транспортирование и хранение биологического материала для исследования методом ПЦР должны осуществляться с соблюдением "холодовой цепи": образцы цельной крови - при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 сут.; образцы плазмы и сыворотки крови - при температуре 2 - 8 °С - в течение 5 сут., при температуре -70 °С - длительно. Образцы остальных видов биологических материалов - при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 сут., при температуре -20 °С - в течение 1 недели, при температуре -70 °С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. Патологический материал для исследования помещают в стерильную посуду (пробирки, банки или другую лабораторную посуду). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью "мазок не фиксирован". В направлении к материалу от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве, достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись "верх, осторожно". Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте. В сопроводительной к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала. Для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительной прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы.

4.6. Подготовка проб к бактериологическому исследованию

Кусочки проб мяса, органов и тканей от трупов помещают в ступку, измельчают ножницами или пестиком, затем заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:10, суспензию через марлевый тампон набирают в шприц или пипетку и переносят в пробирку или колбочку. Воду с илистыми частицами фильтруют через 3 слоя марли. Чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры (N 3) или осадить центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 15 мин. Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем (или фильтры измельчают стерильными ножницами), затем заливают 1 - 2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Осадок после центрифугирования также ресуспендируют в 1 - 2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Полученную микробную взвесь используют для исследования. Отфильтрованную воду обеззараживают добавлением сухой хлорной извести из расчета 200 г на 1 л. Тампоны, которыми делают смывы с объектов окружающей среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют. Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают. От каждой пробы берут 90 - 100 г почвы, помещают в колбу, заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида или 0,5% пирофосфата натрия из расчета получения 15 - 20 мл суспензии. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5 - 10 мин., дают отстояться 3 - 5 мин. и надосадочную жидкость переносят в пробирку для исследования. Для повышения эффективности выявления спор B. anthracis целесообразно проводить двукратную обработку образцов почвы диспергирующей жидкостью с 0,5% пирофосфата натрия. Для этого навеску почвы помещают в стерильный стеклянный или пластиковый флакон и заливают диспергирующей жидкостью из расчета получения 15 - 20 мл суспензии. Суспензию тщательно перемешивают вращательными круговыми движениями в течение 5 - 10 мин., дают отстояться 3 - 5 мин., надосадочную жидкость аккуратно переливают в стерильный пластиковый или стеклянный центрифужный стакан. К образцу почвы вновь добавляют диспергирующую жидкость в половинном объеме и повторяют процедуру элюции. Надосадочные жидкости после первой и второй элюций объединяют в одном центрифужном стакане и центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 15 мин. удаляют механические примеси. Надосадок переносят в стерильный центрифужный стакан и микробную взвесь концентрируют центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 15 мин. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок ресуспендируют в 1 мл стерильного 0,9%-ного раствора натрия хлорида и используют для дальнейшего исследования. Процедуру центрифугирования проводят в отдельных боксовых помещениях или в боксах биологической безопасности III класса ESCO Airstream Class III, либо их аналогах производства других фирм, оборудованных электрическими розетками и УФ-лампами. Различные порошкообразные вещества, в том числе пищевые продукты и корма, обрабатывают аналогично почве, используя в дальнейшем надосадочную жидкость или раствор в случае растворения вещества. Для проб из шкур кусочки массой в 1 г помещают в фарфоровую ступку и заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида из расчета 1:10. Кусочки измельчают ножницами и оставляют при 20 °С на 2 - 3 ч для размягчения материала. После этого пробы хорошо растирают пестиком в той же жидкости до получения волокнистой мезги, мезгу удаляют, предварительно отжав ее пестиком на внутренней боковой поверхности ступки. От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5 - 10 мин. Для освобождения от грубых частиц взвесь можно профильтровать через 2 - 3 слоя марли. Для избавления от посторонней микрофлоры подготовленные по описанной выше процедуре пробы из объектов внешней среды, шерсти и кожи, пищевых продуктов делят на две части, одну из которых подвергают термической обработке на водяной бане при 80 °С в течение 20 мин. Пробы от больного человека и животного, из патологического материала и мяса животных, где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.

4.7. Предварительная обработка проб для исследования методом ПЦР

Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин. до полного образования сгустка. После этого сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. Затем сыворотку в объеме 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Микроаутоптаты, сыворотка, содержимое везикул, отделяемое язв, фрагменты отторгнутого струпа, мазки из полости носа и спинномозговая жидкость не требуют предварительной обработки. Макроаутоптаты массой 0,1 - 1 г помещают в стерильную фарфоровую ступку, добавляют стерильный 0,9%-ный раствор хлорида натрия в соотношении 1:10, измельчают стерильными ножницами с последующим растиранием пестиком. Полученную 10%-ную суспензию центрифугируют или через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость (0,1 - 0,2 мл) стерильным наконечником с аэрозольным барьером в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 - 2,0 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками. Воду, смывы с объектов внешней среды, пробы почвы, пищевых продуктов или кормов, шкур, шерсти предварительно обрабатывают так же, как и для бактериологического исследования, отбирая для исследования методом ПЦР 0,1 - 0,2 мл водной фазы образцов.

5. Поряд