ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella
22.07.2015
ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ГОСТ Р 52814-2007  (ИСО 6579:2002)

Группа Н09             НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ  Метод выявления бактерий рода Salmonella Food products. Method for the detection of Salmonella

ОКС 07.100.30 ОКСТУ 9109 Дата введения 2009-01-01             Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте 1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4 2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов" 3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. N 441-ст 4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 6579:2002 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод выявления Salmonella spp." (ISO 6579:2002 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp.") в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004* (подраздел 3.5). ________________ * На территории Российской Федерации в части разд.8 и приложений Ж, И, К действует ГОСТ Р 1.7-2008.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении Г 5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ 6 ИЗДАНИЕ (апрель 2010 г.) с Поправкой (ИУС 8-2009)

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

     1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной массе или объеме продукта бактерий рода Salmonella, включая Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella в масложировой продукции.

(Поправка).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты: 

 ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия 

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия 

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия 

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия 

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия 

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования*  ________________ * На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

 ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия 

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов 

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, а также по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями: 3.1 бактерии рода Salmonella: Микроорганизмы, которые на агаризованных селективно-диагностических средах образуют типичные или не совсем типичные колонии.

Примечание - Описание и методы определения биохимических и серологических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.2 Выявление бактерий рода Salmonella: Определение присутствия или отсутствия бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

Метод выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех этапов (см. 4.2; 4.3; 4.4; 4.5 и приложение А). 4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в продукте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella.

Забуференную пептонную воду инокулируют при комнатной температуре навеской продукта, затем инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч.

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

Для большего эффекта перед внесением навески продукта забуференную пептонную воду нагревают до температуры (37±1) °С. 4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) или селенитовую среду - инокулируют культурой, полученной по 4.2. После посева RVS-бульон инкубируют при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон и селенитовую среду - при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. 4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-aгap) и

- на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. 4.5 Проведение идентификации

Колонии, предположительно относящиеся к бактериям рода Salmonella, полученные на чашках по 4.4, идентифицируют с помощью биохимических и серологических тестов.

5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества. 5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В. 5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1. 5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2. 5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3. 5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4. 5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек. 5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-aгap) по В.5. 5.2.5.2 Вторая среда по В.6. 5.2.6 Питательный агар по В.7. 5.2.7 Мясо-пептонный агар или ГРМ-агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки) по В.8. 5.2.8 Мясо-пептонный бульон с глюкозой по В.9. 5.2.9 Среды с углеводами (среды Гисса) по В.10. 5.2.10 Трехсахарный железистый агар (TSI-aгap) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого по В.11. 5.2.11 Агар с мочевиной (Кристенсена) по В.12. 5.2.12 L-лизин-декарбоксилазная среда по В.13. 5.2.13 Реактив для определения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-галактозидазы (или используются в соответствии с инструкцией изготовителя готовые бумажные диски) по В.14. 5.2.14 Реактив для реакции Фогес-Проскауера (VP) по В.15. 5.2.15 Реактивы для индольной реакции по В.16. 5.2.16 Триптон/триптофановая среда по В.17. 5.2.17 Бульон Хоттингера по В.18. 5.2.18 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана по В.19. 5.2.19 Полужидкий питательный агар по В.20. 5.2.20 Полужидкий мясо-пептонный агар по В.21. 5.2.21 Физиологический раствор по В.22. 5.3 Сыворотки

Имеется несколько типов агглютинирующих сывороток, содержащих антитела для одного или нескольких О-антигенов, т.е. антисыворотки, содержащие одну или более "О" групп (моновалентные или поливалентные анти-О-сыворотки), анти-Vi-сыворотки и антисыворотки, содержащие антитела для одного или нескольких Н-факторов (моновалентные или поливалентные анти-Н-сыворотки).

Каждое опытное определение должно давать гарантию, что используемая антисыворотка пригодна для выделения всех серотипов бактерий рода Salmonella.

Сухие агглютинирующие адсорбированные О-, Vi-, Н-сальмонеллезные сыворотки промышленного производства готовят перед употреблением по прилагаемой к ним инструкции.

6 Аппаратура, материалы и реактивы

Приемлемой альтернативой посуде многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

Обычное лабораторное оборудование и реактивы для микробиологических исследований по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ГОСТ Р ИСО 7218 (подразделы 4.5 и 4.10).

Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С по ГОСТ Р ИСО 7218 (подраздел 4.6).

Водяная баня, поддерживающая температуру (41,5±1,0) °С, или термостат, поддерживающий температуру (41,5±1,0) °С по ГОСТ Р ИСО 7218 (подраздел 4.9).

Водяная баня, поддерживающая температуру 44 °С - 47 °С и (37±1) °С, по ГОСТ Р ИСО 7218 (подраздел 4.9).

Прибор для мембранной фильтрации.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г (для взвешивания реактивов) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг (для взвешивания продукта) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±20,0 мг.

Микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-1000ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.

Бактериологическая петля диаметром около 3 мм.

рН-метр с точностью калибровки ±0,1 рН при температуре 20 °С - 25 °С по ГОСТ Р ИСО 7218 (подраздел 4.4).

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Пробирки или флаконы соответствующей вместимости.

Могут быть использованы бутылки или флаконы с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

Градуированные или автоматические пипетки вместимостью 10, 2 и 1 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella с градуировкой на 0,5 и 0,1 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.

Чашки Петри среднего размера (диаметр 90 или 100 мм) и/или большие (диаметр 140 мм).

Спирт изобутиловый по ГОСТ 9536. Бриллиантовый зеленый.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Желчь бычья сухая или натуральная.

Железо (III) аммоний цитрат.

Железо (III) цитрат.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Карбамид (мочевина) по ГОСТ 6691.

Контрольный штамм бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе.

Креатин моногидрат.

Ксилоза.

L-лизин гидрохлорид.

4-диметиламинобензальдегид.

Магний хлористый по ГОСТ 4209.

Натрий кислый селенистокислый (NaHSeOГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella).

Натрий гипосульфит (NaГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода SalmonellaSГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода SalmonellaOГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella·5 НГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода SalmonellaО).

Натрий деоксихолат.

о-нитрофенил ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-D-галактопиранозид (ONPG).

Новобиоцин натриевая соль.

Сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные О-сыворотки основных групп А, В, С, Д, Е и редких групп.

Vi- и Н-агглютинирующие сыворотки.

Толуол.

Феноловый красный.

Ферментативный гидролизат сои.

Экстракт мясной.

Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных.

7 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

Важно, чтобы для испытания поступила представительная проба, не поврежденная и не измененная в ходе транспортирования или хранения.

8 Проведение испытания

Схема проведения испытания приведена в приложении Б.  8.1 Навеска и исходное разведение 8.1.1 Общие положения

Для приготовления исходной суспензии используют как разбавитель неселективную среду, указанную в 5.2.1 и 4.2 (забуференную пептонную воду).

Если масса пробы иная, чем 25 г, используют необходимое количество неселективной среды, исходя из соотношения 1:10.

Для уменьшения объема работы, когда испытывают больше одной пробы от определенного продукта и когда очевидно, что объединенная навеска не влияет на результат испытания, - навески объединяют.

Пример: Если необходимо исследовать 10 навесок по 25 г, их объединяют и к 250 г добавляют 2,25 дмГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella неселективной среды. 8.1.2 Специфичность приготовления исходной суспензии для некоторых продуктов

Указанная специфичность приготовления может быть применена только для выявления бактерий рода Salmonella. 8.1.2.1 Какао и какаосодержащие продукты (массовая доля какао более 20%)

Добавляют в забуференную пептонную воду (см. 5.2.1) 50 г некислого казеина или 100 г/дмГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella обезжиренного молочного порошка и, если пищевые продукты предположительно содержат большое количество грамположительных микроорганизмов, прибавляют после 2 ч инкубирования 0,018 г/дмГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella бриллиантового зеленого (3,6 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella/дмГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella раствора, приготовленного по В.4.4). Казеин и молочный порошок добавляют при приготовлении забуференной пептонной воды до стерилизации. 8.1.2.2 Кислые и кислотосодержащие пищевые продукты

При неселективном обогащении должна быть гарантия того, что рН не будет ниже 4,5.

рН кислых и кислотосодержащих продуктов стабилизируют путем использования забуференной пептонной воды двойной концентрации.

Допускается также при высеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения рН сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводить до (7,0±0,2).

При высеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до (7,0±0,2) в посевах.

Доведение рН проводят с соблюдением правил асептики с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемых растворов устанавливают опытным путем. 8.2 Неселективное обогащение

Инкубируют исходную суспензию (см. 8.1.1) при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч. 8.3 Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 8.2, пересевают в среды для селективного обогащения. Для этого по 1 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella культуры пересевают в 10 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella RVS-бульона и в 10 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella селенитовой среды или в 10 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella тетратионатного бульона Мюллер-Кауфмана.

Посевы на RVS-бульоне инкубируют при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч (следят за тем, чтобы температура не превышала 42,5 °С), а на тетратионатном бульоне и селенитовой среде посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

Если из одного пищевого продукта проведен высев нескольких навесок (каждой отдельно) для выявления бактерий рода Salmonella, то допускается из каждого посева по 8.2 пересев проводить в один флакон с каждой селективной питательной средой (RVS-бульоном, тетратионатным бульоном Мюллер-Кауфмана, селенитовой средой). При этом количество селективной среды во флаконе должно быть увеличено по сравнению с 10 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella во столько раз, из скольких посевов проводят пересев.

Свежие продукты, не содержащие поврежденных микроорганизмов, подвергнутые каким-либо воздействиям, например сушке, заморозке и другим, допускается высевать непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения. Соотношение между количеством высеваемого продукта и средой должно быть не менее 1:10. 8.4 Пересев на чашки и идентификация 8.4.1 Культуры через 24 ч инкубирования на селективных средах пересевают по ГОСТ 26670 так, чтобы получить хорошо изолированные колонии, на XLD-aгap и на одну из агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

При отсутствии больших чашек используют для посева петлей две средние чашки (одну за другой). 8.4.2 Чашки переворачивают (см. 8.4.1) вверх дном и помещают в термостат при температуре (37±1) °С. 8.4.3 После инкубирования в течение (24±3) ч, а на бриллиантовом зеленом агаре - 48 ч, просматривают чашки (см. 8.4.2) и отмечают присутствие типичных колоний бактерий рода Salmonella и не совсем типичных колоний, которые могут быть бактериями рода Salmonella. Отмечают их местоположение на дне чашки. Типичные колонии бактерий рода Salmonella, вырастающие на XLD-aгape, имеют черный центр и слегка прозрачную зону красноватого цвета, что принадлежит цвету индикатора.

Бактерии рода Salmonella НГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода SalmonellaS-отрицательные варианты (например S. Paratyphi А) образуют на XLD-aгape розовые колонии с темным розовым центром, лактозоположительные бактерии рода Salmonella на XLD-aгape - желтые колонии с почернением или без него.

На висмут-сульфит агаре бактерии рода Salmonella образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями.

На среде Эндо бактерии рода Salmonella образуют круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные колонии.

На среде Плоскирева бактерии рода Salmonella образуют бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо, колонии.

На среде Левина бактерии рода Salmonella образуют прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые колонии.

На бриллиантовом зеленом агаре бактерии рода Salmonella образуют красноватые или розовые, почти белые колонии (их цвет зависит от штамма и срока инкубирования). Лактозоположительные и сахарозоположительные микроорганизмы образуют зеленоватые колонии, окруженные яркой желто-зеленой зоной.

Агар с бриллиантовым зеленым применяют для выделения сальмонелл, кроме Salmonella Туphi и Salmonella Paratyphi.

Отсутствие в посевах на селективно-диагностических средах типичных или не совсем типичных колоний для бактерий рода Salmonella свидетельствует об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске (объеме) продукта.

При наличии хотя бы на одной селективно-диагностической среде типичных или не совсем типичных колоний для бактерий рода Salmonella проводят их дальнейшую идентификацию. 8.5 Идентификация 8.5.1 Общие положения

Для определения биохимических признаков бактерий рода Salmonella допускается использование наборов тест-систем. Эти наборы используют в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, зарегистрированных в Российской Федерации, например "API 20E", "Rapid 20E". 8.5.2 Выделение колоний для идентификации

Для идентификации берут с каждой чашки (две чашки среднего или одну большого размера) каждой селективной среды (см. 8.4.3) сначала одну колонию типичную или не совсем типичную, а затем четыре колонии, если первая окажется отрицательной.

Рекомендуется брать сразу пять колоний для идентификации в случае эпидемиологической ситуации. Если на одной чашке менее пяти типичных или не совсем типичных колоний, то для идентификации берут все колонии.

Переносят отобранные колонии на поверхность предварительно подсушенного питательного агара (см. 5.2.6) или мясо-пептонного агара, или ГРМ-агара (см. 5.2.7) в чашках Петри или на скошенную поверхность среды в пробирках. Для подтверждения берут полностью изолированные колонии. Инкубируют инокулированные чашки или пробирки при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

Используют только чистые культуры для биохимической и серологической идентификации. 8.5.2.1 Окраска по Граму

Из отобранных для биохимической идентификации колоний готовят мазки и окрашивают по Граму по ГОСТ 30425.

Бактерии рода Salmonella являются грамотрицательными палочками с закругленными концами. 8.5.3 Биохимическая идентификация

У отобранных и предварительно пересеянных грамотрицательных культур изучают характер роста на трехсахарном железистом агаре (TSI-aгape) или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого, возможность расщепления мочевины, образования ацетоина, индола, ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-галактозидазы, L-лизиндекарбоксилазы, ферментации сахарозы и маннита, а также подвижность. 8.5.3.1 Общие положения

Петлей инокулируют специфические среды, указанные в 8.5.3.2-8.5.3.9, каждой культурой, полученной из колоний по 8.5.2. 8.5.3.2 TSI-aгap (см. 5.2.10), среда Олькеницкого или агар Клиглера

Засевают штрихом скошенную поверхность агара (среды Олькеницкого) и уколом - столбик. Инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. 

Интерпретируют изменения в среде следующим образом: а) столбик агара (среды Олькеницкого)

- желтый - глюкоза положительная (глюкозу ферментирует);

- красный или неизменившийся - глюкоза отрицательная (глюкозу не ферментирует);

- черный - образование сероводорода;

- пузырьки или разрывы - образование газа из глюкозы; б) скошенная поверхность агара (среды Олькеницкого)

- желтая - лактоза и/или сахароза положительные (лактозу и/или сахарозу ферментирует);

- красная или неизменившаяся - лактоза и сахара отрицательные (ни лактозу, ни сахарозу не ферментирует).

Агар Клиглера содержит два сахара, поэтому по скошенной поверхности учитывают только ферментацию лактозы.

Типичные культуры бактерий рода Salmonella показывают щелочную (красную) поверхность и кислый (желтый) столбик с образованием газа (пузырьков) и примерно в 90% случаев образуется сероводород (черный агар).

Если изолированы лактозоположительные бактерии рода Salmonella, то поверхность TSI-aгapa желтая. Предварительное определение культур бактерий рода Salmonella не может основываться только на результатах теста на TSI-aгape.

Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа. 8.5.3.3 Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (см. 5.2.11)

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.

При положительной реакции - расщеплении мочевины с выделением аммония цвет фенолового красного меняется от розового до светло-вишневого.

Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину. 8.5.3.4 L-лизиндекарбоксилазная среда (см. 5.2.12)

Инокулируют снизу жидкую среду. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

Помутнение и пурпурный цвет среды после инкубирования указывают на положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию. Salmonella Paratyphi А не образует L-лизиндекарбоксилазу, остальные образуют. 8.5.3.5 Определение ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-галактозидазы (5.2.13)

Суспендируют петлей культуру в 0,25 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella физиологического раствора, прибавляют одну каплю толуола и встряхивают пробирку. Помещают пробирку в водяную баню при температуре 37 °С и оставляют примерно на 5 минут. Затем добавляют 0,25 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella реактива для определения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-галактозидазы и перемешивают.

Оставляют пробирку в водяной бане при температуре 37 °С в течение (24±3) ч, наблюдая за изменением цвета через определенные промежутки времени.

Желтый цвет указывает на положительную реакцию. Изменение цвета обнаруживается примерно через 20 мин.

Бактерии рода Salmonella, кроме S.arizonae, не обладают ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-галактозидазой.

Для определения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella-галактозидазной активности допускается использование ONPG-дисков. Для этого испытуемые культуры высевают на среду, содержащую лактозу в концентрации 0,1%, или агар Клиглера, или трехсахарный агар, или агар Олькеницкого. Посевы инкубируют в течение (18±2) ч при температуре (37±1) °С. Петлей отбирают выросшую культуру и готовят из нее густую суспензию в 0,5 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella стерильной дистиллированной воды. К полученной суспензии добавляют один ONPG-диск и помещают в водяную баню при температуре (37±1) °С. Желтое окрашивание, появившееся через 15-20 мин, указывает на положительную реакцию. Для окончательного учета отрицательного результата посевы продолжают инкубировать в течение 2, 4 и 24 ч. 8.5.3.6 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) (5.2.14) 

Суспендируют петлей испытуемую культуру в стерильной пробирке, содержащей 3 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella VP среды или мясо-пептонного бульона с глюкозой.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

После инкубации прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, перемешивают содержимое пробирки после прибавления каждого реактива.

Появление через 15 мин от розового до светло-красного окрашивания указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

Допускается определение ацетоина проводить без применения раствора креатина. Для этого после инкубирования к 1 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella раствора 1-нафтола и 0,2 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella раствора гидроокиси калия. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию. 8.5.3.7 Определение образования индола (см. 5.2.15)

Культуры пересевают в пробирку, содержащую 5 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella триптон/триптофановой среды, или в бульон Хоттингера, или в мясо-пептонный бульон с L-триптофаном. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

После инкубирования к посевам прибавляют по каплям 1 смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella реактива Эрлиха или Ковача, содержимое пробирки перемешивают.

Образование красного кольца указывает на положительную реакцию. Желто-коричневое кольцо указывает на отрицательную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют индол. 8.5.3.8 Определение ферментации маннита и сахарозы

Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

Бактерии рода Salmonella не ферментируют сахарозу, но ферментируют маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ. 8.5.3.9 Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар или полужидкий мясо-пептонный агар.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вокруг места укола.

Бактерии рода Salmonella подвижны, кроме S. gallinarum и S. pullorum. 8.5.3.10 Интерпретация биохимических тестов приведена в таблице А.1 (приложение А).  8.5.4 Серологическая идентификация 8.5.4.1 Общие положения

Определение присутствия соматического О-антигена, антигена вирулентности Vi-, жгутикового Н-антигена в изолированных колониях (см. 8.5.2) проводят с помощью реакции агглютинации на предметном стекле с соответствующими сыворотками после исключения самоагглютинирующих штаммов. Сыворотки используют в соответствии с инструкцией изготовителя, если есть отличие от описания, приведенного ниже.

Серологическую идентификацию для подтверждения принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, предварительно пересеянными на поверхность мясо-пептонного агара или ГРМ-агара. 8.5.4.2 Исключение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Допускается размешивание части колонии в капле воды и перемешивание этого раствора с одной каплей физиологического раствора.

Покачивают осторожно стекло в течение 30-60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации. 8.5.4.3 Определение наличия О-антигенов

Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными О-сыворотками основных групп А, В, С, D, Е, а затем, если не выявлено О-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в инструкции, прилагаемой к сывороткам.

Агглютинация (наличие О-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

Используют поли- и моновалентные сыворотки, одну после другой. 8.5.4.4 Определение Vi- и Н-антигенов

Наличие Vi- и Н-антигенов определяют при необходимости по санитарно-эпидемиологическим показаниям.

Перед выявлением Н-антигенов испытуемой культурой инокулируют полужидкий агар. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Полученную культуру используют для выявления Н-антигенов.

Наличие Vi- и Н-антигенов определяют, пользуясь указаниями, приведенными в 8.5.4.3. 8.5.5 Интерпретация биохимических и серологических реакций

Интерпретация подтверждающих тестов (см. 8.5.3 и 8.5.4) для испытанных колоний (см. 8.5.2) приведена в таблице 1.

Таблица 1 - Интерпретация подтверждающих тестов Биохимические реакции  Самоагглютинация Серологические реакции Интерпретация Типичные Нет О-, Vi- или Н-антигены положительные Штамм относится к бактериям рода Salmonella Типичные Нет Все реакции отрицательные Могут быть бактерии рода Salmonella Типичные Да Не тестируется (см. 8.5.4.2)

Нетипичные реакции Нет/Да О-, Vi- или Н-антигены положительные

Нетипичные реакции Нет/Да

Все реакции отрицательные Не относятся к бактериям рода Salmonella 

При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качестве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разделе 6.

Культуры, предположительно отнесенные к бактериям рода Salmonella, передают в компетентные аккредитованные центры по изучению этих бактерий для окончательной идентификации. Культуру при этом сопровождают всей полученной информацией с указанием наименования продукта, из которого выделен штамм.

В этом случае результаты выявления бактерий рода Salmonella выдают после получения ответа по окончательной идентификации.

При выявлении бактерий рода Salmonella используют схему, указанную в приложении Б.

9 Обработка результатов

9.1 Результаты оценивают по каждой пробе в отдельности. 9.2 Результаты выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта записывают: "бактерии рода Salmonella обнаружены или не обнаружены в ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella г (смГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella) продукта" (ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии рода Salmonella).

10 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать информацию:

- об используемом методе отбора проб;

- использовании каких-либо отклонений в методе обогащения или инкубирования;

- обо всех условиях испытания, не указанных в настоящем стандарте, или считающихся необязательными, со всеми деталями, которые могли повлиять на результаты;

- о полученных результатах.

Протокол испытания включает также информацию о том, с использованием какой среды для чашек (см. 5.2.5) получен положительный результат.

Приложение А (обязательное). Интерпретация биохимических тестов

Приложение А (обязательное)

Таблица А.1 - Количество положительных реакций для штаммов бактерий рода Salmonella В процентах Тесты Штамм